Номер№81 (3) 2020

ДОБОВА ВАРІАБЕЛЬНІСТЬ РІВНЯ ЕНДОТЕЛІАЛЬНОЇ NО-СИНТАЗИ (NOS3) В СИРОВАТЦІ КРОВІ У ЖІНОК, ХВОРИХ НА РЕВМАТОЇДНИЙ АРТРИТ: ЗВ’ЯЗОК ІЗ ПЕРЕБІГОМ ЗАХВОРЮВАННЯ

Заічко К.О., Станіславчук М.А.

Резюме. Ревматоїдний артрит (РА) належить до найбільш вагомих причин погіршення здоров’я та стійкої втрати працездатності населення різних країн. Провідною патогенетичною ланкою деструктивних змін у суглобах при РА вважають ангіогенез, одним із модуляторів якого виступає ендотеліальна NO-синтаза (NOS3). Встановлення зв’язку циркадних ритмів продукції NOS3 з перебігом захворювання дозволить персоніфікувати діагностично-лікувальні заходи у хворих на РА. Мета: вивчити добову варіабельність рівня NOS3 в сироватці крові у жінок, хворих на РА, та оцінити зв’язок із перебігом захворювання. Матеріали та методи. Обстежено 173 хворих на РА (100% жінки) віком 43,7±7,35 року та 34 жінки групи контролю віком 42,4±10,5 року. Діагноз РА встановлювали за критеріями ACR/EULAR 2010. Рівень NOS3 в сироватці крові визначали о 08:00 та 20:00 за набором фірми Cloud-Clone Corp. Дослідження проведено із дотриманням біоетичних норм. Статистичну обробку результатів проводили у пакеті прикладних програм SPSS22. Результати. У хворих на РА реєструються нижчі рівні NOS3 в сироватці крові о 08:00 та 20:00, ніж у практично здорових осіб. Зниження ранкової та вечірньої продукції NOS3 у пацієнтів з РА асоціюється з підвищенням рентгенологічної стадії захворювання та функціональних порушень і не залежить від серологічного варіанта захворювання; встановлений зв’язок між рівнем NOS3 в сироватці крові, рентгенологічною стадією та показниками активності захворювання і функціональною здатністю хворих (DAS28, CDAI, RAID, HAQ). Висновки. У жінок, хворих на РА, нижчі рівні NOS3 в сироватці крові в ранкові та вечірні години, ніж у здорових осіб. Зниження ранкової продукції NOS3 у пацієнтів із РА є предиктором тяжкості перебігу захворювання.

УДК 616.72-002.77-055.2:546.172.6

DOI: 10.32471/rheumatology.2707-6970.79.14821

Вступ

Ревматоїдний артрит (РА) належить до найвагоміших причин погіршення здоров’я та стійкої втрати працездатності населення різних країн. Поширеність РА неухильно підвищується, зокрема, в канадський популяції (Онтаріо) за 10 років вона зросла з 0,49 до 0,9% [22]. За даними офіційної статистики МОЗ України, у 2017 р. було зареєстровано 120 465 хворих на РА, а захворюваність становила 3569 осіб [1].

Провідною патогенетичною ланкою деструктивних змін у суглобах при РА вважають ангіогенез, який є складовою панусу в умовах імунозапальної реакції синовії [21]. Головним медіатором ангіогенезу є васкулоендотеліальний фактор росту (VEGF), продукцію якого активують прозапальні цитокіни, простагландини, фактори клітинної проліферації, інгібітори апоптозу тощо [10, 19]. Одним із механізмів проангіогенної дії VEGF є модуляція експресії ендотеліальної NO-синтази (NOS3) та активація продукції NO [17, 18]. NOS3 експресується не лише в ендотелії судин, а й в остеоцитах і регулює остеогенез [4, 6]. Експресія NOS3 виявлена в синовіоцитах та інтерстиціальних клітинах синовіальної оболонки хворих на РА [13]. У хворих на РА в плазмі крові та синовіальній рідині виявляли високі концентрації кальретикуліну — мультифункціонального протеїну ендоплазматичного ретикулума, який підвищує активність NOS3 [9]. Водночас клініко-патогенетичне значення NOS3 у хворих на РА не з’ясовано і потребує детальніших досліджень.

Мета дослідження — вивчити добову варіабельність рівня NOS3 в сироватці крові у жінок, хворих на РА, та оцінити зв’язок із перебігом захворювання.

Матеріали та методи дослідження

У дослідження було включено 173 хворих на РА (100% жінки), середній вік (М±σ) становив 45,9±8,79 року, тривалість захворювання — 7,96±6,38 року. Дослідження проведено з дотриманням біоетичних норм відповідно до положень ВООЗ, Ґельсінкської декларації Генеральної асамблеї Всесвітньої медичної асоціації (1989), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1977), Міжнародної ради медичних наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983), діючих законів України, що засвідчено комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова.

Діагноз РА встановлювали на основі критеріїв ACR/EULAR (2010) [2], наказу МОЗ України від 11.04.2014 р. № 263. Рентгенологічну стадію РА встановлювали за Steinbroker, функціональний клас (ФК) визначали згідно з переглянутими критеріями ACR 1991 р. [12]. Активність РА встановлювали за клінічними індексами DAS28-ШОЕ, CDAI, функціональну здатність визначали за індексом HAQ (україномовна версія (HAQ-DI Ukraine/Ukrainian, ID 2387)), вплив захворювання на загальний стан пацієнта визначали за індексом RAID (Rheumatoid Arthritis Impact of Disease, україномовна версія) [3, 11].

Серед обстежених переважали особи із серопозитивним варіантом РА (ревматоїдний фактор (РФ) виявлявся у 78,6% осіб, антитіла до циклічного цитрулінованого пептиду (АЦЦП) — у 83,2% осіб), помірною та високою активністю процесу (DAS28-ШОЕ >5,1 виявлявся у 65,9% осіб), ІІ–ІІІ рентгенологічною стадією (80,9% осіб), ІІ–ІІІ ФК (96,5% осіб). Позасуглобові прояви РА виявлені у 42 (24,3%) хворих, найчастіше реєстрували анемію хронічного захворювання (21,4% осіб) та лімфаденопатію (17,9% осіб).

Рівень NOS3 в сироватці крові визначали 2 рази на добу (08:00 та 20:00). Забір крові здійснювали за допомогою вакуумних систем «Vacuette» (Greiner Bio-One, Австрія). Перед забором крові обстежувані особи уникали фізичних та психічних навантажень, вранці забір крові проводили натще, ввечері — щонайменше через 2 год після їжі. Сироватку отримували шляхом центрифугування цільної крові при 1500 g упродовж 20 хв при 18–22 ˚С і до тестування зберігали при –20 ˚С. Рівень NOS3 в сироватці крові визначали імуноферментним методом за набором «Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Nitric Oxide Synthase 3, Endothelial (NOS3)» (Cloud-Clone Corp., США, SEA868Hu, L170922832) відповідно до інструкції фірми-виробника. Для встановлення референтних значень рівня NOS3 було обстежено 34 практично здорових жінки віком 42,4±10,5 року, які склали групу контролю.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили у пакеті прикладних програм MS Excel, IBM Statistics SPSS 22. Обчислювали середню арифметичну величину, квадратичне відхилення та середні помилки середньої арифметичної. Достовірність відмінностей для парних та незалежних вибірок оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента (при параметричному розподілі), U-критерію Манна — Уїтні (при непараметричному розподілі). Нормальність розподілу оцінювали за критерієм Шапіро — Уїлка. Для оцінки зв’язку між показниками проводили кореляційний аналіз за Спірманом. При перевірці статистичних гіпотез критичним рівнем значущості відмінностей вважали р<0,05.

Результати та обговорення

Встановлено (табл. 1), що у практично здорових осіб та хворих на РА реєструються добові коливання рівня NOS3 в сироватці крові із підвищенням у вечірній час в середньому в 1,38 та 1,42 раза (р<0,001). Однак у хворих на РА рівні NOS3 о 08:00, 20:00та середньодобовий були достовірно нижчими (в 1,2 раза в середньому), ніж у осіб групи контролю.

Таблиця 1
Добова варіабельність рівня NOS3 в сироватці крові хворих на РА
Характеристика групи Рівень NOS3 в сироватці крові, нг/л (M±σ)
08:00 20:00 середній
1 Контроль, n=34 512,9±92,8 706,5±103,2* 627,1±92,6
2 Хворі на РА, n=173 415,7±87,7 593,2±124,7* 504,4±95,3
р2,1 <0,001 <0,05 <0,01
Вікові групи хворих на РА
3 18–25 років, n=7 471,9±62,6 707,9±119,4 589,9±78,5
4 26–44 років, n=58 423,2±105,0 611,2±134,2 517,2±108,2
р3,4 >0,05 <0,05 <0,05
5 45—60 років, n=108 408,0±77,3 576,1±115,2 492,0±85,4
р3,5 <0,05 <0,05 <0,05
р3,4 >0,05 >0,05 >0,05
Тривалість РА
6 <5 років, n=55 431,4±98,3 618,9±135,8 525,1±106,4
7 5—10 років, n=78 416,3±86,9 597,4±115,4 506,8±89,4
р7,6 >0,05 >0,05 >0,05
8 >10 років, n=40 397,7±63,0 555,3±113,5 479,5±77,0
р8,6 <0,05 <0,05 <0,05
р8,7 >0,05 >0,05 >0,05
Імунологічна характеристика РА
9 Серо(+) за РФ, n=136 416,0±84,8 593,3±124,6 504,7±91,3
10 Серо(+) за АЦЦП, n=144 416,2±84,4 597,0±123,9 506,6±90,4
р9,10 >0,05 >0,05 >0,05
11 Cеро(–) за АЦЦП та РФ, n=28 411,9±113,5 596,8±144,4 504,4±120,3
р9,11 >0,05 >0,05 >0,05
р10,11 >0,05 >0,05 >0,05
Рентгенологічна стадія РА за Steinbroker
7 І стадія, n=33 450,6±109,1 694,1±128,9 572,3±103,3
8 ІІ стадія, n=72 423,9±86,8 588,2±113,6 506,0±89,8
р7,8 >0,05 <0,05 <0,05
9 ІІІ стадія, n=68 390,0±68,8 549,5±106,5 469,8±78,8
р7,9 <0,05 <0,01 <0,01
р8,9 <0,05 <0,05 <0,05
Функціональний клас
10 ФК І, n=6 480,6±75,6 686,3±112,5 583,5±87,4
11 ФК ІІ, n=108 421,6±93,2 608,8±126,4 515,2±97,8
р10,11 >0,05 >0,05 >0,05
12 ФК ІІІ, n=59 398,1±74,1 559,1±110,8 478,6±81,6
р10,12 <0,05 <0,05 <0,05
р11,12 >0,05 <0,05 <0,05

У хворих на РА реєстрували достовірне пригнічення продукції NOS3 з віком, збільшенням тривалості захворювання та підвищенням рентгенологічної стадії, без суттєвих відмінностей між серопозитивними (за РФ та/або АЦЦП) та серонегативними пацієнтами. Так, у хворих на РА віком ≤25 років рівні NOS3 вранці (о 08:00), ввечері (о 20:00) та середньодобовий були достовірно вищими на 15,7; 22,9 та 19,9%, ніж у хворих віком 45–60 років. У хворих із тривалістю РА >10 років рівні NOS3 о 08:00, 20:00 та середньодобовий були достовірно нижчими на 18,4; 24,2 та 21,0%, ніж у хворих із тривалістю РА до 5 років.

Додатковий аналіз рівня NOS3 у підгрупах пацієнтів, розподілених за рентгенологічною стадією залежно від тривалості захворювання, виявив достовірну закономірність (рис. 1): у групі хворих із тривалістю РА до 5 років відмінності за ранковим та вечірнім рівнем NOS3 у осіб з І, ІІ та ІІІ стадією за Steinbroker виявилися більш вираженими, ніж у групах з тривалістю захворювання ≥5 років. Зокрема, у хворих, які до 5 років досягли ІІІ стадії за Steinbroker, рівні NOS3 о 08:00, 20:00 та середньодобовий виявилися достовірно нижчими на 24,7; 23,6 та 24,0%, а у хворих із ІІ стадією — нижчими на 15,5; 14,8 та 15,3%, ніж у хворих із І стадією відповідно. Зі збільшенням тривалості РА відмінності за рівнем NOS3 між пацієнтами з ІІ та ІІІ стадією втрачалися.

Рис. 1.
Добова варіабельність рівня NOS3 в сироватці крові хворих на РА за зіставлення тривалості та рентгенологічної стадії захворювання (M±σ). *р<0,05; **р<0,01 порівняно з групою РА І рентгенологічної стадії

За результатами ROC-аналізу (рис. 2) встановлено, що ранковий рівень NOS3 >420 нг/л є пре­диктором повільної рентгенологічної прогресії РА з чутливістю 0,808 та специфічністю 0,793 (площа під ROC-кривою — 0,881; 95% довірчий інтервал (СІ) 0,794–0,969; р<0,001). У хворих на РА з рівнем NOS3 >420 нг/л шанси повільної прогресії РА є вищими, ніж у хворих з аберантними рівнями NOS3 (відносний ризик (OR)=2,48; 95% CI 1,02–6,04). ROC-аналіз вечірнього та середньодобового рівнів NOS3 засвідчив, що ці показники мають меншу діагностичну цінність як предиктори рентгенологічної прогресії РА: площі під ROC-кривими становили 0,639 (95% СІ 0,492–0,786; р=0,077) та 0,743 (95% СІ 0,612–0,874; р=0,002) відповідно.

Рис. 2.
ROC-крива NOS3 в сироватці крові (08:00) як предиктор повільної рентгенологічної прогресії РА

Аналіз клініко-лабораторних показників активності захворювання у хворих на РА свідчить, що зниження ранкової продукції NOS3 асоціюється з помірним підвищенням больового синдрому (табл. 2). Так, у групі хворих на РА з рівнем NOS3 >469 нг/л (квартиль Q4) кількість болючих суглобів (КБС) виявилася меншою (в 1,36 раза), а загальна оцінка здоров’я пацієнтом (ЗОЗП) — нижчою в 1,32 раза, ніж у хворих з рівнем NOS3 <357 нг/л (квартиль Q1). Від квартиля Q1 до квартиля Q4 спостерігалася тенденція до зниження показників активності запального процесу — кількості набряклих суглобів (КНС), ШОЕ та СРБ.

Таблиця 2
Показники активності захворювання у хворих на РА залежно від квартильного розподілу рівня NOS3 в сироватці крові (08:00)
Квартилі NOS3 Показники активності РА (M±σ)
КБС КНС ШОЕ, мм/год СРБ, мг/л ЗОЗП ВАШ, мм
Q1 (<357 нг/л), n=45 15,0±6,81 7,60±3,74 26,1±13,7 16,8±12,6 68,1±15,6
Q2 (357–415 нг/л), n=43 13,2±7,14 7,67±4,95 28,8±14,8 16,2±14,8 59,1±17,3
Q3 (415–469 нг/л), n=42 12,8±6,45 6,98±4,32 27,0±13,9 14,5±12,3 58,5±17,3
Q4 (>469 нг/л), n=43 11,0±6,24 5,95±3,91 23,2±15,9 13,0±12,4 51,3±20,2
р2,1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
р3,1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
р3,2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
р4,1 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,01
р4,2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
р4,3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Зниження ранкової продукції NOS3 асоціювалось з підвищенням активності захворювання відповідно до індексів DAS28-ШОЕ, DAS28-СРБ, CDAI, HAQ та RAID (табл. 3). Так, у квартилі Q1 частка осіб з DAS28-ШОЕ >5,1; CDAI >22; HAQ >2 та RAID >6 була вищою в 1,51; 2,02; 2,87 та 2,04 раза, ніж у квартилі Q4.

Таблиця 3
Частота виявлення високої активності захворювання у хворих на РА відповідно до квартильного розподілу рівня NOS3 в сироватці крові (08:00)
Квартилі NOS3 Кількість хворих з високою активністю РА, n (%)
DAS28-ШОЕ >5,1 DAS28-СРБ >5,1 CDAI >22 HAQ >2 RAID >6
Q1 (<357 нг/л), n=45 35 (77,8%) 36 (80,0%) 40 (88,9%) 12 (26,7%) 30 (66,7%)
Q2 (357–415 нг/л), n=43 30 (69,8%) 24 (55,8%) 30 (69,8%) 8 (18,6%) 23 (53,5%)
Q3 (415–469 нг/л), n=42 27 (64,3%) 23 (54,8%) 30 (71,4%) 6 (14,3%) 19 (45,2%)
Q4 (>469 нг/л), n=43 22 (51,2%) 17 (39,5%) 22 (51,2%) 4 (9,3%) 14 (32,6%)
р2,1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
р3,1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
р3,2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
р4,1 <0,05 <0,01 <0,01 <0,05 <0,01
р4,2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
р4,3 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Достовірність відмінностей визначена за Fisher exact test, 2-tailed.

У хворих на РА встановлені достовірні асоціативні зв’язки між показниками перебігу захворювання та рівнем NOS3 у сироватці крові. Вік і тривалість захворювання достовірно обернено корелювали з вечірнім та середньодобовим рівнем NOS3 (rSp=–0,21–0,25; p<0,05), але з ранковим рівнем зв’язок був слабким (rSp=–0,15–0,16; р=0,053–0,039). Натомість, зв’язок показників клінічної активності захворювання (КБС, DAS28-СРБ, CDAI та ін.) був більшим з ранковим рівнем NOS3 (rSp=–0,27–0,32; р<0,01), ніж з вечірнім показником (rSp=–0,19–0,27; р<0,05). У хворих на РА не виявлено достовірних асоціацій між показниками продукції NOS3 та лабораторними маркерами активності запального процесу (ШОЕ та СРБ).

Таким чином, зниження продукції NOS3, особ­ливо в ранковий період, супроводжується підвищенням тяжкості перебігу РА. Зниження рівня NOS3 в сироватці крові у хворих на РА може бути зумовлено дією різних чинників. Як відомо, з віком відбувається поступове пригнічення експресії NOS3, знижується NO-синтазна активність цього ензиму, натомість посилюється його здатність до продукції активних форм кисню [5, 8]. Відомо, що глюкокортикоїди, прозапальні цитокіни (ФНП-α), ядерний фактор κB інгібують експресію еNOS та зменшують стабільність її мРНК [15, 16, 20]. Продукція зазначених чинників має циркадний характер і є найбільш вираженою вранці [7], що може детермінувати ранкове зниження рівня NOS3 в сироватці крові у хворих на РА.

Слід відзначити, що через систему NOS3/NO реалізується дія найпотужнішого проангіогенного медіатора — VEGF, який за умов РА володіє прозапальним, антиапоптотичним та остеодеструктивним ефектом [14]. Вочевидь, зниження активності NOS3 повинно сприятливо впливати на перебіг РА, однак результати наших досліджень виявилися протилежними. Найімовірнішим поясненням цього протиріччя може бути описаний в роботах Т. Nakagawa (2013, 2007) феномен у регуляції системи VEGF/NOS3 [17, 18]. Зазвичай пригнічення ендотеліальної продукції NO відбувається за умов зниженої експресії VEGF, однак при значному падінні активності NOS3 експресія VEGF парадоксально зростає і через NO-незалежні сигнальні системи стимулює патологічний ангіогенез [17, 18]. Зниження рівня NOS3 в сироватці крові може свідчити про дисбаланс у системі VEGF/NOS3. Таким чином, зниження продукції NOS3 у жінок, хворих на РА, асоціюється з вищою активністю захворювання і тяжчими деструктивними змінами в суглобах. Перспективами подальших досліджень є детальніше вивчення добової варіабельності рівня NOS3 у хворих на РА (в тому числі чоловічої статі) залежно від генетичних та набутих чинників, які асоціюються з розладами ендотеліальної продукції NO.

Висновки

1. У хворих на РА реєструються нижчі рівні NOS3 в сироватці крові о 08:00 та 20:00, ніж у практично здорових осіб. Зниження ранкової та вечірньої продукції NOS3 у хворих на РА асоціюється з підвищенням рентгенологічної стадії захворювання та функціональних порушень і не залежить від серологічного варіанта захворювання.

2. Підвищення активності РА за DAS28-ШОЕ, DAS28-СРБ, CDAI, втрата функціональної здатності хворих за HAQ та збільшення впливу захворювання за RAID асоціюються зі зниженням рівня NOS3 вранці, в той час як вік і тривалість захворювання — зі зниженням вечірнього рівня NOS3 в сироватці крові.

3. У хворих на РА рівень NOS3 >420 нг/л вранці є предиктором повільної прогресії рентгенологічних змін в суглобах упродовж перших 5 років із чутливістю 80,8%, специфічністю — 79,3%.

Список використаної літератури

Суточная вариабельность уровня эндотелиальной NО-синтазы (NOS3) в сыворотке крови у женщин, больных ревматоидным артритом: связь с течением заболевания

Е.А. Заичко, Н.А. Станиславчук

Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Резюме. Ревматоидный артрит (РА) относится к одной из наиболее весомых причин ухудшения здоровья и стойкой утраты трудоспособности населения разных стран. Ведущим патогенетическим звеном деструктивных изменений в суставах при РА считают ангиогенез, одним из модуляторов которого выступает эндотелиальная NO-синтаза (NOS3). Установление связи циркадных ритмов продукции NOS3 с течением заболевания позволит персонифицировать лечебно-­диагностические мероприятия у больных РА. Цель: изучить суточную вариабельность уровня NOS3 в сыворотке крови у женщин, больных РА, и оценить связь с течением заболевания. Материалы и методы. Обследовано 173 больных РА (100% женщины) в возрасте 43,7±7,35 года и 34 женщины группы контроля в возрасте 42,4±10,5 года. Диагноз РА устанавливали по критериям ACR/EULAR 2010. Уровень NOS3 в сыворотке крови опре­деляли в 08:00 и 20:00 по набору фирмы Cloud-Clone Corp. Исследование проведено с соблюдением биоэтических норм. Статистическую обработку результатов проводили в пакете прикладных программ SPSS22. Результаты. У больных РА регистрируются более низкие уровни NOS3 в сыворотке крови в 08:00 и 20:00, чем у практически здоровых лиц. Снижение утренней и вечерней продукции NOS3 у больных РА ассоци­ируется с повышением рентгенологической стадии заболевания и функциональных нарушений и не зависит от серологического варианта заболевания; установлена связь между уровнем NOS3 в сыворотке крови, рентгенологической стадией и показателями активности заболевания и функциональной способностью больных (DAS28, CDAI, RAID, HAQ). Выводы. У женщин, больных РА, ниже уровни NOS3 в сыворотке крови в утренние и вечерние часы, чем у здоровых лиц. Снижение утренней продукции NOS3 у пациентов с РА является предиктором тяжести течения заболевания.

Ключевые слова: ревматоидный артрит, эндотелиальная NO-синтаза, суточная вариабельность, женский пол.

Адреса для листування:
Станіславчук Микола Адамович
21018, Вінниця, вул. Пирогова, 46
Вінницький національний медичний
університет ім. М.І. Пирогова,
кафедра внутрішньої медицини № 1
E-mail: mstanislav53@yahoo.com

No Comments » Додати свій
Leave a comment